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Vorwort zur 1. Auflage XIII Vorwort zur 2. Auflage XV Autorenliste XVII Glossar XXI Einfuhrung 1 Teil I Allgemeine Grundlagen und Praanalytik 3 1 Grundlagen der molekularen Diagnostik 5 Frank Thiemann 1.1 Die DNA 5 1.2 Die RNA 9 1.3 DNA-Replikation 12 1.4 Das Gen 13 1.5 Genomorganisation bei Prokaryonten 14 1.6 Genomorganisation bei Eukaryonten 14 1.7 Die Proteinbiosynthese 16 1.7.1 Die Transkription 16 1.7.2 Die Translation 21 1.8 Grundbegriffe in der molekularen Diagnostik 30 1.8.1 Inzidenz 30 1.8.2 Pravalenz 30 1.8.3 Mortalitat 31 1.8.4 Letalitat 31 1.8.5 Goldstandard 31 1.8.6 Richtigkeit und Prazision 31 1.8.7 Sensitivitat und Spezifitat 32 1.8.8 Pradiktiver Wert 34 2 Praanalytik in der molekularen Diagnostik 37 Frank Thiemann 2.1 Administrative Massnahmen 37 2.2 Probengewinnung 38 2.2.1 Zeitpunkt der Probengewinnung 39 2.2.2 Proben- und Transportrohrchen 41 2.3 Hinweise zu Transport und Verpackung 45 2.3.1 Kategorie A UN 2814 45 2.3.2 Kategorie B UN 3373 46 2.3.3 Freigestellte medizinische Proben 46 2.4 Praanalytische Schritte im Labor 46 2.4.1 Raumliche Voraussetzungen 47 2.4.2 Vollautomatische Analysesysteme 49 Teil II Methoden 51 3 Isolierung von Nukleinsauren 53 Edgar Setzke und Hans Nitschko 3.1 Einleitung 53 3.2 Die Probenvorbereitung 53 3.3 Der Zellaufschluss in Abhangigkeit des Probenmaterials und der zu isolierenden Nukleinsaure 55 3.4 Isolierung von DNA 56 3.4.1 Phenol/Chloroform-Extraktion 56 3.4.2 Silikamembranen oder mit Silika beschichtete Oberflachen (magnetische Partikel) 57 3.4.3 Anionenaustauscher-Saulen 61 3.5 Isolierung von RNA 63 3.5.1 Isolierung von Virus-RNA 63 3.5.2 Isolierung von zellularer RNA 64 3.6 Manuelle und automatisierte Systeme zur Nukleinsaureisolierung in der molekularen Diagnostik 65 3.6.1 Manuelle Extraktionssysteme 66 3.6.2 Automatisierte Extraktionssysteme 68 3.7 Uberprufung der Menge, Reinheit und Qualitat von RNA und DNA 72 3.7.1 Photometrische Bestimmung der Nukleinsaure [Menge/(Reinheit)] 73 3.7.2 Abschatzung der DNA-Menge durch Gelelektrophorese und Anfarbung mit Ethidiumbromid oder anderen Farbstoffen [Menge/(Qualitat)] 73 3.7.3 Bioanalyzer [Menge/Qualitat] 74 3.7.4 Spotmethode [Menge] 75 3.7.5 DNA/Zellzahlbestimmung durch PCR genomischer Sequenzen [Menge] 76 3.8 Lagerung der isolierten RNA/DNA 77 3.8.1 Lagerung von Standards 78 4 Amplifikation und Detektion von Nukleinsauren 79 Stefan Lorkowski, Ofert Landt, Carsten Tiemann, Michael Weizenegger, Ulrich Eigner, Charlotte Sager, Frank Thiemann und Paul M. Cullen 4.1 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 79 4.1.1 Geschichtlicher Hintergrund 79 4.1.2 Das Prinzip der PCR 80 4.1.3 Die Komponenten der PCR 85 4.1.4 Anforderungen an das Ausgangsmaterial 89 4.1.5 PCR-Zusatze 91 4.1.6 Weitere PCR-Methoden 92 4.2 Entwicklung (Design) von Real time-PCR Assays: Primerauswahl und Sonden 99 4.2.1 Grundsatze 100 4.2.2 Primer 100 4.2.3 Sonden 102 4.2.4 Farbstoffe und Multiplex-PCR 103 4.2.5 Kriterien der Leistungsbewertung 103 4.3 Detektion von PCR-Produkten 106 4.3.1 Agarosegelelektrophorese 106 4.3.2 Chip-Elektrophorese (Lab-on-a-Chip) 109 4.3.3 PCR-ELISA und partikelbasierte Detektion 110 4.3.4 Reverse Hybridisierung 114 4.3.5 HyBeacon-Technologie 118 4.4 Real time-PCR 121 4.4.1 Interkalierende Farbstoffe (SYBR) 121 4.4.2 TaqMan-Sonden 122 4.4.3 Dark Quencher (BHQ, black hole quencher) 123 4.4.4 MGB-Sonden (minor grove binder) 123 4.4.5 Molecular Beacons 124 4.4.6 Modifizierte Oligonukleotidbausteine 124 4.4.7 Hybridisierungsproben 125 4.4.8 Scorpion-Primer 126 4.4.9 Schmelzpunktanalytik 127 4.4.10 High Resolution Melt (HRM) 128 4.4.11 Miniaturisierte Technik 129 4.4.12 Quantitative PCR 129 4.4.13 Absolute Quantifizierung 130 4.4.14 Relative Quantifizierung 132 4.4.15 Dual Target 133 4.4.16 Digitale PCR (dPCR) 134 4.5 Multiplex-PCR 135 4.5.1 Mit Dual Priming -Oligonukleotiden der Multiplex-PCR auf die Sprunge helfen 137 4.5.2 MLPA als Werkzeug fur die Multiplex-PCR 140 4.5.3 Wenn es etwas mehr sein soll: Multiplex-PCR mit Luminex 144 4.5.4 Multiplex-PCR: Die Qual der Wahl 149 4.6 Weitere Nukleinsaure-Amplifikationsverfahren 149 4.6.1 DNA-Sonden-Assays (Gensonden) 150 4.6.2 Transcription-Mediated Amplifikation (TMA) 150 4.6.3 Hybridization Protection Assay (HPA) 153 4.6.4 Nucleic Acid Sequence based Amplifikation (NASBA) 154 4.6.5 Strand-Displacement Amplification (SDA) 156 4.6.6 Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) 158 4.6.7 Massenspektrometrie als neue Option 158 4.6.8 Das Prinzip 162 4.6.9 Massenspektrometrie im PCR-Labor 164 4.6.10 Die Target-Regionen und ihre Analyse 167 4.6.10.1 Der Einsatz im Routinelabor 169 4.7 DNA-Mikroarrays 170 5 DNA-Sequenzierung 173 Andre Frontzek 5.1 DNA-Sequenzierung nach Sanger 173 5.2 Pyrosequenzierung 180 5.3 Minisequenzierung 183 5.4 Sequenzierung mit Mikroarrays 185 5.5 Sequenzierung die nachste Generation 186 5.6 Die Zukunft der Sequenzierung 191 Teil III Indikationen 193 6 Indikationen fur die molekulare Diagnostik 195 Holger F. Rabenau, Udo Reischl, Uwe Lang, Matthias Aymanns, Tim Hagedorn, Kim Koop, Jana Schroder und Andreas Uekotter 6.1 Erkrankungen durch Viren 198 6.2 Erkrankungen durch Bakterien, Pilze und Parasiten 221 6.3 Molekulare Methoden in der Krankenhaushygiene 227 6.3.1 Bedeutung der Krankenhaushygiene in Deutschland 227 6.3.2 Gesetzliche Rahmenbedingungen 228 6.3.3 Molekularbiologische Erregersuchtests 229 6.3.4 Molekulare Typisierungsmethoden in der Krankenhaushygiene 231 7 Humangenetik 235 Hanns-Georg Klein, Imma Rost, Christoph Marschall, Karin Mayer, Sebastian Eck, Ina Vogl, Christina Sofeso, Camilla Ladinig, Wolfgang Rupprecht, Paul M. Cullen, Brigitte Welling, Uwe Heinrich, Annett Wagner, Tanja Hinrichsen, Thomas Harasim und Birgit Busse 7.1 Klinische Genetik 236 7.1.1 Gesetzliche Rahmenbedingungen 236 7.1.2 Genetische Beratung 237 7.1.3 Erbgange 239 7.2 Molekulargenetik 241 7.2.1 Monogene Erkrankungen 241 7.2.2 Next Generation Sequencing in der Diagnostik 247 7.3 Pradispositionsdiagnostik 250 7.3.1 Pradispositionsdiagnostik fur polygene Erkrankungen 251 7.4 Klassische und molekulare Zytogenetik 261 7.4.1 Postnataldiagnostik 261 7.4.2 Pranataldiagnostik 267 7.4.3 Tumorzytogenetik 268 7.4.4 Molekulare Zytogenetik 271 7.5 Nicht invasiver Pranataltest (NIPT) 276 7.6 Reproduktionsgenetik 278 7.6.1 Polkorperdiagnostik Praimplantationsdiagnostik 278 7.7 Pharmakogenetik 282 7.7.1 Verstoffwechselung von Arzneimitteln 283 7.7.2 Transportproteine 285 7.7.3 Pharmakogenetik in der Routinediagnostik 285 7.8 Abstammungsanalysen 286 7.8.1 Gesetzliche Grundlagen 288 7.8.2 Weitere Anwendungen von Mikrosatellitenanalysen 288 8 Immungenetik und Transfusionsmedizin 291 Hannah Rabenstein, Kristin Kipper, Barbara Bangol und Kaimo Hirv 8.1 MHC-Komplex und HLA-System 291 8.1.1 Klinische Bedeutung der HLA-Typisierung 292 8.1.2 Methodische Aspekte der HLA-Typisierung 295 8.2 Primare Immundefekterkrankungen 298 8.3 Hereditare periodische Fiebersyndrome 299 9 Molekulare Onkologie und Pathologie 301 Tanja Hinrichsen, Stefanie Kuhner, Oliver Wachter und Barbara Dockhorn-Dworniczak 9.1 Leukamien 302 9.1.1 Ablauf einer genetischen Diagnostik am Beispiel der chronischen myeloischen Leukamie (CML) 303 9.2 Solide Tumore 307 9.2.1 Kolorektales Karzinom (KRK) 308 Teil IV Qualitat 313 10 Qualitatssicherung in der molekularen Diagnostik 315 Holger F. Rabenau und Udo Reischl 10.1 Praanalytik 317 10.1.1 Labortechnische und -organistorische Voraussetzungen 317 10.1.2 Kontrollen 317 10.2 Validierungen von molekularbiologischen Verfahren 318 10.3 NAT-spezifische Aspekte der Qualitatssicherung RiLiBAK 2013 321 Gesetze und Normen zur Regelung der molekularen Labordiagnostik im deutschsprachigen Raum 323 Paul M. Cullen und Michael Neumaier EU-Richtlinie 98/79/EG uber In vitro-Diagnostik 323 Besondere Bedeutung der EU-Richtlinie fur die Molekulardiagnostik 325 Regelung von Nukleinsaureamplifikationstechniken (NAT) bei der Diagnose von Infektionskrankheiten 325 Das deutsche Gendiagnostikgesetz 325 Aufbau und Inhalt des Gendiagnostikgesetzes 326 Was vom Gendiagnostikgesetz nicht geregelt wird 326 Was vom Gendiagnostikgesetz geregelt wird 326 Anwendung des Gendiagnostikgesetzes was in der taglichen Praxis beachtet werden muss 327 Gendiagnostikgesetz: Kritik, Interpretation und Modifikationen 333 Weiterfuhrende Literatur 337 Index 341